Το Παλάτι του Μεγάλου Μαγίστρου ή Καστέλλο είναι χτισμένο στο βορειοδυτικό ψηλότερο σημείο της μεσαιωνικής πόλης και δεσπόζει με τον όγκο του πάνω από αυτή και τα λιμάνια της. Ισχυρό καθώς ήταν και δεμένο άρρηκτα με την οχύρωση, μετείχε ενεργά στην άμυνα και ήταν το τελευταίο καταφύγιο του πληθυσμού σε περίπτωση κατάληψης της πόλης από τον εχθρό.

Το παλάτι του Μεγάλου Μαγίστρου είναι ένα ορθογώνιο κτίριο (διαστ. 80Χ75μ) διαμορφωμένο γύρω από μια μεγάλη αυλή (διαστ. 50Χ40μ. περίπου). Χτίστηκε στο τέλος του 7ου αι. με σκοπό να αποτελέσει την Ακρόπολη του πρωτοβυζαντινού "φρουρίου" και εξακολούθησε να παίζει τον ίδιο ρόλο σε όλη τη διάρκεια της βυζαντινής περιόδου και της ιπποτοκρατίας (1309-1522). Οικοδομικές επεμβάσεις έγιναν πριν από την εγκατάσταση των ιπποτών στο νησί, οι οποίοι από το α' τέταρτο του 14ου αι. άρχιεσαν να επισκευάζουν τη βυζαντινή ακρόπολη και να τη μετασκευάζουν σε κατοικία του Μεγάλου Μαγίστρου και διοικητικό κέντρο του ιπποτικού κράτους.

Στη νότια όψη του κτιρίου βρίσκεται η κύρια πύλη, πλαισιωμένη από δύο επιβλητικούς πύργους. Η δυτική όψη του διατρυπάται από μια πύλη, που εμπρός της ορθώνεται ένας ορθογώνιος και ψηλός πύργος, έργο πιθανώς του Μεγάλου Μαγίστρου Pierre d'Aubusson (1476-1503).

Στη βόρεια πλευρά υπάρχουν υπόγειοι χώροι που χρησίμευαν ως αποθήκες και πιθανώς εκεί κατέφευγε, σε περίπτωση εχθρικής επιδρομής, μέρος του άμαχου πληθυσμού της πόλης. Στο ισόγειο, γύρωα από την ορθογώνια αυλή, υπήρχαν καμαροσκέπαστες μικρές και μεγάλες αίθουσες που χρησίμευαν ως βοηθητικοί χώροι. Ο όροφος του παλατιού από τα μέσα περίπου του 19ου αι. είχε καταρρεύσει εντελώς και ελάχιστα στοιχεία του διασώθηκαν μέχρι το 1937, οπότε άρχισε το έργο της "αναστήλωσης", με μεγάλης κλίμακας και συχνά αυθαίρετες επεμβάσεις. Στον όροφο βρίσκονταν διάφορες επίσημες αίθουσες, όπως η "Μεγάλη Αίθουσα του Συμβουλίου" και η τραπεζαρία, καθώς και τα ιδιαίτερα διαμερίσματα του Μεγάλου Μαγίστρου, γνωστά με την κοινή ονομασία "Μαργαρίτες". Δεξιά της μνημειώδους μαρμάρινης κλίμακας που οδηγεί στον α' όροφο ιδρύθηκε απί ιταλοκρατίας παρεκκλήσι, μέσα στο οποίο είναι στημένο χάλκινο άγαλμα του αγίου Νικολάου, αντίγραφο ομώνυμου έργου του Ντονατέλλο που βρίσκεται στο Μπάρι.

Σε πολλές αίθουσες του ορόφου έχουν στρωθεί μωσαϊκά δαπέδου υστεροελληνιστικών, ρωμαϊκών και παλαιοχριστιανικών χρόνων, τα περισσότερα από κτίρια της Κω.

Την περίοδο της Τουρκοκρατίας το παλάτι χρησιμοποιήθηκε ως φυλακή, χρήση που θα διατηρήσει και επί ιταλοκρατίας, μέχρι την εποχή που αποφασίστηκε η "αναστήλωσή" του.

Σε αίθουσες του ισογείου παρουσιάζονται δύο μεγάλες μόνιμες εκθέσεις: στη βορινή πλευρά η έκθεση με θέμα την πόλη της Ρόδου από την ίδρυσή της (408 π.Χ.) μέχρι τη ρωμαιοκρατία και στη νοτιοδυτική πλευρά, δίπλα από το παρεκκλήσι, η έκθεση με θέμα τη Ρόδο από τον 4ο αι. μ.Χ. έως την κατάληψή της από τους Τούρκους (1522).